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循环肿瘤DNA调研系列之三

日期: 2015-05-07
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 ----血液样本收集和循环DNA提取及循环DNA的检测分析方法

血液样本收集和循环DNA提取

    5 ml EDTA抗凝血

    4°C2500 rpm离心10 min,去除细胞

    80°C储存,备用

    用DNA试剂盒提取DNA(如QIAGEN、Puregene的血液游离核酸提取试剂盒)

循环DNA的检测分析方法

循环DNA的检测分析方法大体分为2类:低通量检测方法和高通量检测方法。低通量检测方法包括SYBER green法、实时PCR法和基于实时PCR所发展起来的一系列技术等,可以检测总的循环DNA的浓度以及ctDNA中的关键的突变(如EGFR的19号和21号外显子),微卫星不稳定性和甲基化位点等。总体上低通量检测方法所获信息局限。要想获得癌症基因组的全貌,需要应用高通量检测方法分析ctDNA。

循环DNA的检测分析方法也可分为定量和定性分析2类:定性分析主要检测血清或血浆中肿瘤特异性基因改变,包括基因突变、抑癌基因启动子高甲基化、MSI(微卫星不稳定)等;定量分析以检测血液循环DNA总量为指标。上述两种方法均可反映肿瘤的存在和严重程度。

1.循环DNA的检测分析方法(低通量的总的循环DNA定量方法):实时PCR法

例子:通过定量血清中hTERT(human telomerase reverse transcriptase,端粒酶逆转录酶)基因的拷贝数间接定量总的循环DNA。总的循环DNA水平可用于区分癌症患者和正常个体。用以区分肺癌和正常人的循环DNA界值定为20 ng/ml,特异性达到83%,敏感性达到79%。也可用于预后判定,循环DNA浓度越高,个体生存期越短。

2.ctDNA的检测分析方法:数字聚合酶链式反应技术(低通量突变检测方法)

例子:用数字聚合酶链式反应技术法检测K-ras突变(胰腺癌),K-ras突变在组织的中检出率是74.7%,在ctDNA中的检出率是62.6%,二者的一致率为77.3%。

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